Propriétés biochimiques, biophysiques et thermiques de la phosphatase alcaline du thermophile Thermus sp. NTU-237

H.C. Nguyen, S.P. Wu, C.H. Su, T.S. Hwang

Résumé


Description du sujet. Les phosphatases alcalines (APases) sont fréquemment employées comme marqueurs non radioactifs pour la détection spécifique de protéines ou d'ADN cibles en médecine clinique et en biologie moléculaire. Toutefois, leur application en biotechnologie industrielle nécessite une bonne stabilité tant thermique que de conservation. Nos recherches préliminaires ont montré que l'APase de Thermus sp. NTU-237 (TsAPase) est thermostable et présente une haute activité. Il est donc intéressant d'établir les conditions optimales de son emploi. Objectifs. Caractériser l'APase de la souche thermophile Thermus sp. NTU-237 et évaluer ses potentialités d'application. Méthode. Le gène de l'APase de Thermus sp. NTU-237 a été cloné pour être exprimé dans Escherichia coli. Cela a permis l'étude des effets sur l'activité enzymatique TsAPase, de la température, du tampon, des teneurs en glycérol, en dodécyl sulfate de sodium (SDS) et en NaCl pour cerner les conditions optimales d'essai. De plus, les potentialités d'application des TsAPase ont été investiguées au moyen du substrat chromogène 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitro bleu de tétrazolium (BCIP/NBT). Résultats. La TsAPase recombinante fonctionne comme un dimère d'une masse moléculaire de 109 kDa. Les alignements de séquences de la TsAPase avec d'autres APases thermophiles connues et l'APase d'E. coli dénotent une bonne conservation des acides aminés impliqués dans l'activité catalytique et dans des fonctions de liaison à certains résidus. Cette découverte suggère que le mécanisme catalytique des TsAPases est identique à celui d'autres APases. L'activité TsAPase s'est avérée être inhibée par le glycérol et le SDS, alors qu'elle s'est accrue en présence de NaCl et de tampon Tris-HCl. Les paramètres cinétiques Km, kcat, et Vmax ont été établis à 81 µM, 6,08 s-1 et 6,76 U·mg-1, respectivement. La température optimale de la TsAPase était de 80 °C. La TsAPase est stable à température ambiante durant plus de 10 jours. De plus, la TsAPase s'est montrée capable de catalyser la déphosphorylation du BCIP, provoquant par la même occasion le développement à température ambiante de la couleur bleue du substrat transformé. Conclusions. Les résultats rapportés illustrent les potentialités d'utilisation de la TsAPase, que ce soit dans le domaine médical ou en recherche fondamentale.

Mots-clés


Thermus; thermostable; phosphatase alcaline; caractérisation; chromogénique; application; enzymologie

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ISSN : 1370-6233 / eISSN : 1780-4507 | Facteur d'impact 5 ans : 0,676 Google scholar Most cited papers

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